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【DNA克隆原创系列一】DNA克隆常用方法

免费信息发布网   发布时间:2020-05-13   发布者:李文彦

DNA克隆的方法有很多种,比如传统的T4连接酶介导的DNA克隆、EASY克隆,无缝拼接克隆等,下面具体介绍一下这些克隆方法。


一、T4连接酶介导的DNA克隆


传统的分子克隆,通常需要使用相同的限制性内切酶酶切载体和目的片段,使得载体和片段产生相同的粘性或平末端,使用T4 DNA连接酶对其进行连接,转化,挑取阳性克隆,得到重组质粒(相关产品:T4 DNA Ligase)


为了更方便的对DNA进行克隆,后续又将克隆的载体进行了简化,出现了T载体,这样就可以不用酶切,直接将片段连接到载体上,以便于DNA的保存及后续扩增。


以TA克隆为例来介绍整个连接过程。常规的连接是一个三分子共同反应的过程(图1),载体、片段和连接酶碰撞在一起,发生反应,完成连接过程。为了得到更多的阳性克隆,我们会倾向于加入更多的片段、载体和连接酶,以提高分子碰撞机率,但同时也会遇到一个问题,过高的DNA浓度和T4连接酶浓度会增加分子间相互作用促进串联体和载体自连的形成,反而导致片段和酶的利用率降低。所以在进行TA克隆时,并不是DNA和酶加入的越多越好。


使用这种方法进行克隆,如果需要连接平末端的DNA片段(比如Pfu类酶扩增的片段),则需要进行额外的加A尾反应(可以使用Taq酶完成加A)。



图8 无缝拼接引物设计原则和方法


四、 三种载体构建方法比较


三种基因克隆的方法均有不同的特点,下表从原理和特点方面对这三种方法进行了比较(表1)。



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